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致病性真菌的PCR扩增检测

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致病性真菌的PCR扩增检测

讨论

近年来,临床上酵母菌引起粘膜和系统感染的发生率上升很快,特别是念珠菌已成为医源性感染的常见病原菌之一5。目前,利用形态学和生物化学等方法将致病性酵母菌鉴定到种的技术已非常成熟,但通常耗时3d至5d,若在此期间患者不进行有效的抗真菌治疗,导致体内真菌大量繁殖,后果往往较为严重。真菌PCR技术及其相关技术为临床致病性真菌的检测提供了简单、快速的方法,但该方法的顺利开展,需要有一种快速、且费用和技术要求均较低的模板制备方法支撑。目前常用的真菌DNA提取方法有氯化苄法,异硫氰酸胍法等,这些方法经过不断的改进,已十分可靠,广泛应用于真菌分子生物学实验中DNA的提取。但这些方法用于PCR模板的制备,步骤非常繁琐,需要多种试剂,耗时长,费用相对较高,也不适合临床小体积标本的核酸提取。

本研究中采用基因释放剂制备致病性酵母菌的PCR模板,直接用于PCR扩增。由BioVentures公司提供的基因释放剂中含有活性亲水多聚体,除能帮助细胞裂解外,还可作为沉淀与吸附蛋白质的成核位点。同时该多聚体对脂质和多糖有亲和性,而对核酸的亲和性非常低,因此提取物无须纯化,可直接加入PCR试剂进行PCR扩增反应。所以该方法操作非常简单、快速,整个模板制备过程仅需30min左右,而传统方法通常都需要2h左右。该方法用于9种临床常见的致病性酵母菌的检测,PCR成功扩增受试菌株的靶DNA,无非特异性扩增带出现。敏感性试验结果显示,对于白色念珠菌,用基因释放剂法配合文献报道的PCR扩增方法,检测灵敏度可达10个孢子/mL。与常用的氯化苄法相比较,操作步骤大大简化。从电泳结果看,采用基因释放剂制备模板,其PCR产物的量明显高于氯化苄法。同时基因释放剂对于干扰扩增反应的抑制剂有拮抗作用6,有利于消除临床样品中干扰因素的影响,提高PCR扩增反应的敏感性和可靠性。本实验用该方法检测带菌血标本,取得满意结果,阳性扩增带清晰可辨。因此该方法完全可用于临床标本中致病性真菌的PCR扩增检测,从而早期快速诊断深部真菌病。